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文章目录

1. 血液细胞分类

2. HSC标志物

3. 人造血干/祖细胞表型鉴定

4. 人造血干细胞（HSC）整体研究

5. 脐血CD34+原代细胞

6. 造血干/祖细胞的分离

造血干细胞（HSC）

人造血干细胞（HSC）是具有自我更新和多向分化潜能的人造造血始祖细胞，可分化为红细胞、白细胞、血小板等各类血细胞，广泛应用于造血功能重建、血液病治疗等领域。磁珠分离常用 CD34 + 免疫磁珠法，利用 HSC 表面 CD34 抗原特异性结合磁珠，通过磁场实现高效富集，纯度可达 90% 以上。扩增多采用无血清培养基，添加 SCF、TPO、IL-3 等细胞因子，维持其干性并促进增殖。鉴定核心检测 CD34+CD38 - 表型（流式细胞术）及干性基因（如 HOXB4）表达。CFU 检测通过甲基纤维素培养基培养

1. 血液细胞分类


人外周血白细胞 (A) 用CD45染色后，依据CD45的表达水平呈现分离的三个细胞群：粒细胞 (P1)、单核细胞(P2)和淋巴细胞(P3) 。 (B) FSC和 SSC散点图.检测CD45 表达和FSC、SSC分析能够帮助鉴别区分你所感兴趣的细胞群 Im, M. et al*.

造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)

细胞因子：SCF, TPO, Flt3 ligand

Markers:

人：CD34⁺, CD90^+,, Lin^-, CD38^-/low, CD45RA^-, CD49f⁺

小鼠: Lin^-, CD117⁺, Sca-1⁺

磁珠分选kit：

人：

小鼠：

培养基：

小分子抑制剂：StemRegenin 1 (SR1), UM171, GW9662

Lymphoid progenitor

细胞因子：SCF, IL-7

Markers:

人：

小鼠：

磁珠分选kit：

人：

小鼠：

培养基：

小分子抑制剂：

B cell lineage

SCF, IL-1β, IL-6， IL-7， IL-11， IL-12

Markers:

人：CD19⁺

小鼠: CD19⁺

磁珠分选kit：

人：

小鼠：

培养基：

Activated B细胞

TGF-β1, BAFF, IL-2, IL-4, IFN-γ, CD40L, anti-CD40, anti-CD180, anti IgM/IgD

Plasma cell

Markers:

人：CD138⁺

小鼠：CD138⁺

NK cell Lineage

SCF, IL-2, IL-12

Markers:

人: CD3^-, CD16⁺, CD56+

小鼠: CD3^-, CD49b⁺

磁珠分选kit：

人：

小鼠：

培养基：

Activated NK细胞

IL-2, IL-12, IL-15, IL-18

T cell Lineage:

细胞因子：SCF, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7

Markers:

人：CD3⁺, CD56^-

小鼠: CD3⁺, CD49b^-

磁珠分选kit：

人：

小鼠：

培养基：

NK T细胞

IL-2, IL-7, IL-15, CD137L, anti CD3, anti CD28

Markers:

人：CD3⁺, CD56⁺

小鼠：

γδ T细胞

IL-2, IL-7, IL-15, CD137L, anti CD3, anti CD28

CD4 naïve T细胞

IL-2, IL-7, IL-15, CD137L, anti CD3, anti CD28

Markers: CD3, CD4, TCRα/β, CD62L, CD197 (CCR7), CD45RA, CD45RB

Human:

CD4⁺CD45RA⁺CD45RO^-, CD8-, CD14-, CD16^-, CD19^-, CD20^-, CD36^-, CD56^-, CD66b^-, CD123^-, TCRγ/δ^-, CD235a^-

Th1细胞

IL-2, anti CD3, anti CD28, IL-12, IL-18, IL-27, IFN-γ, anti IL-4

Markers: CD3, CD4, CD119 (IFN-γ Ra), CD183 (CXCR3), CD195 (CCR5), CD218a (IL-18Ra)， LT-βR， CD366 (Tim-3)

Th2细胞

IL-2, anti CD3, anti CD28, IL-4, IL-6,IL-31,IL-33,TSLP, IL-25, anti IFN-γ, anti-IL-12/IL-23P40

Markers: CD3, CD4, CD119 (IFN-γ Ra), CD193 (CCR3), CD194 (CCR4), CDw198 (CCR8)， CRTH2， IL-33Ra, CD365 (Tim-1)

Th17细胞

IL-2, anti CD3, anti CD28, TGF-β1, IL-1β, IL-6, IL-21, IL-23, anti IL-2, anti L-4, anti IFN γ

Markers: CD3, CD4, TCRα/β, CD161, CD194 (CCR4), CD196 (CCR6)， IL-23R

Treg 细胞

IL-2, anti CD3, anti CD28, TGF-β1

Markers:CD3, CD4, CD25, FoxP3

Th9细胞

IL-2, anti CD3, anti CD28, TGF-β1，IL-4， anti IFN-γ

Markers: CD3, CD4, TCR a/β

Tfh 细胞

IL-2, anti CD3, anti CD28, IL-6, IL-21, CXCL13

Markers: CD3, CD4, TCRα/β, CD84, CD126(IL-6Ra),CD150 (SLAM),CD154 (CD40L), CD185 (CXCR5), CD252 (OX40L), CD278 (ICOS), CD279 (PD1)

Th22 细胞

IL-2, anti CD3, anti CD28, IL-6, TNF-α

Markers: CD3, CD4, TCRα/β, CD194 (CCR4), CD196 (CCR6)， CCR10

CD8 naïve T细胞

IL-2, IL-7, IL-15, CD137L, anti CD3, anti CD28

Markers:

Human: CD8⁺CD45RA⁺CCR7⁺CD45RO^-CD57^-CD56^-, CD4^-, CD14^-, CD16^-, CD19^-, CD20^-, CD36^-, CD94^-, CD123^-, CD244^-, TCRγ/δ^-, CD235a^-

Treg细胞

IL-2, IL-7, IL-15, CD137L, anti CD3, anti CD28

Markers:CD3, CD4, CD25, FoxP3

Megakaryocyte erythrocyte progenitor

细胞因子：SCF, IL-3， TPO

Markers:

人：

小鼠：

磁珠分选kit：

人：

小鼠：

培养基：

Megakaryocyte lineage（巨核细胞系）

IL-3, GM-CSF, TPO

Markers:

人：

小鼠：

磁珠分选kit：

人：

小鼠：

培养基：

platelets (Resting)

Markers:

人: CD42b⁺

小鼠: CD41⁺

platelets (activated)

Markers:

人: CD62p⁺

小鼠: CD62p⁺

Erythroid lineage

IL-3， GM-CSF, EPO

Markers:

人：

小鼠：

磁珠分选kit：

人：

小鼠：

培养基：

Red blood cells 红细胞

Markers:

人: CD235a⁺

小鼠：Ter119⁺

Common myeloid progenitor

IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF, EPO

Markers:

人：

小鼠：

Monocytic lineage

IL-3, IL-4, M-CSF, GM-CSF

Markers:

人：CD14⁺, CD16±, CD64⁺

小鼠: CD11b^hi, CD115^hi, Gr-1^lo, Ly-6C^±

Osteoclast

M-CSF, RAK-L

Macrophage

Flt3 ligand, M-CSF, GM-CSF, IL-34

Markers:

人：CD11b⁺, CD68⁺, CD163⁺

小鼠：F4/80⁺, CD68⁺

Mature macrophage

TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-1β, IL-13

Dendritic cell（DC）

IFN-γ, IL-4, GM-CSF, Flt3 ligand, IL-34

Markers:

人：CD1c⁺, CD83⁺, CD141⁺, CD209⁺, MHC Ⅱ⁺

小鼠: CD11c⁺, MHC Ⅱ⁺

Mature dendritic cell

IL-1β, TNF-a， IL-6, IL-23, CD40L

Basophilic lineage

IL-3, IL-4, IL-10, TSLP

Markers:

人：2D7 antigen, CD117^-, CD123⁺, CD203c⁺ ,FcεRIα⁺

小鼠: CD200R3⁺, FcεRIα⁺

Eosinophilic lineage

IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-5

Markers:

人：CD11b⁺, CD193⁺, EMR1⁺,Siglec-8, (CD16^-CD66b⁺CD45⁺)

小鼠：CD11b⁺, CD193⁺, F4/80⁺, Siglec-F⁺

Neutrophilic lineage

IL-3, IL-4, GM-CSF, G-CSF

Markers:

人：CD15⁺, CD16⁺, CD49d^-

小鼠：CD11b⁺， CD115^-, Ly-6B.2, Ly-6c^lo/neg, Ly6G⁺, Gr-1⁺

Mast cell lineage

IL-3, IL-4, SCF, TGF-ß1

Markers:

人：

小鼠：

2. HSC标志物

Human

Pan markers

HSC

CMP

CLP

CD34

CD117(c-kit)

CD164

Surface

CD38^low/neg

CD59

CD133○

CD135(FIt3)

CD338

Lin^neg

Surface

CD38○

CD45RA

CD123^low

CD131

CD135(FIt3)

CD174

CD173

Lin^neg

Surface

CD7

CD38

CD45RA

CD90^low

CD110

CD117(c-kit)^low

CD127（IL-7Rα）○

HLA-DR

Lin^neg

Intracellular/

transcription factor

GATA-3

TdT

Intracellular/

transcription factor

Ikaros

PU.1

Intracellular/

transcription factor

Aiolos

c-myb

GATA-3

PU.1

TdT

Mouse

HSC

CMP

CLP

Surface

CD34^neg

CD38^low/neg

CD59

CD117(c-kit)○

CD133○

CD135(FIt3)

CD338

Lin^neg

Surface

CD38○

CD45RA

CD123^low

CD131

CD135(FIt3)

CD174

CD173

Lin^neg

Surface

CD7

CD38

CD45RA

CD90^low

CD110

CD117(c-kit)^low

CD127（IL-7Rα）○

HLA-DR

Lin^neg

Intracellular/

transcription factor

GATA-3

TdT

Intracellular/

transcription factor

Ikaros

PU.1

Intracellular/

transcription factor

Aiolos

c-myb

GATA-3

PU.1

TdT

↑=Upregulated ↓=Downregulated ○=Key marker ●=Subset

3. 人造血干/祖细胞表型鉴定

选择正确的细胞是所有细胞实验开始的第一步。免疫磁珠细胞分选可以快速、简便地分离特定的细胞种类，但在有的实验中还需要进行更加精确的分选。作为一种革命性的实验工具，流式细胞术（Flow Cytometry）彻底改变了我们分选高特异性细胞群的能力。鉴定造血干细胞（HSCs）只能通过体内实验检测HSCs在移植后重建造血系统的能力。鉴定造血祖细胞（HPCs）的方法除了体内移植，还可以在体外检测其增殖和分化能力。多参数流式细胞术是一种非常重要的工具，它可以基于细胞表面标志物对这些造血干/祖细胞（HSPC）群体进行表型细分，并了解这种异质细胞群中不同亚群的多种功能。

人HSPCs中最被熟知的标志物是细胞表面糖蛋白CD34。该标志物可用于从骨髓和血液中鉴定和分离HSPCs，因为它在大多数（非全部）人HSPCs上高表达，但不表达于成熟血细胞。CD34⁺细胞不表达成熟血细胞具有的所谓的谱系（Lin）标志物，例如CD2、CD3、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和CD235。而一些标志物在CD34⁺细胞群上的表达具有异质性，例如CD38、CD45RA、CD90和CD49f。如表1所示，可以通过这些标志物的不同组合来区分具有不同造血重建潜力的HSPC亚群。

表1. HSC和祖细胞亚群及标志物
细胞亚群	造血干细胞（HSC）		多能祖细胞（MPP）	多能淋系祖细胞（MLP）	普通髓系祖细胞（CMP)
标志物	Lin^-CD34⁺CD38^- CD45RA^-CD90⁺CD49f⁺		Lin^-CD34⁺CD38^- CD45RA^-CD90^-CD49f^-	Lin^-CD34⁺CD38^- CD45RA⁺CD90^-	Lin^-CD34⁺CD38⁺ CD45RA^-
细胞亚群	巨核细胞-红系祖细胞（MEP）	巨核细胞集落形成单位（CFU-Mk）	红系爆式形成单位（BFU-E）	粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMP）	普通淋系祖细胞（CLP）
标志物	Lin^-CD34⁺CD38^lo CD45RA^-	Lin^-CD34⁺CD38⁺ CD45RA^-	Lin^-CD34⁺CD38⁺CD45RA⁺	Lin^-CD34⁺CD38^- CD45RA^-	Lin^-CD34⁺CD38^-/lo CD45RA⁺CD90^-

当研究罕见的干/祖细胞群时，对免疫表型分型数据的精准度要求非常高。然而在骨髓和血液中HSPC的比例非常低。因此，为了节省时间和试剂，并提高分析的准确性，最好对已纯化的CD34⁺或谱系去除的细胞进行免疫表型分型。实验的设计和荧光抗体的选择很大程度上取决于实验目的和可用的流式细胞仪的配置。我们对经典论文和最新的文献进行数据汇编整理，以构建优化用于这些细胞鉴定的HSPC表型鉴定表。

用于HSPC表型分析的推荐染料及抗体

表2展示了用于HSPC亚群分析的推荐荧光标记抗体。该表在设计时选择用最亮的荧光染料PE检测表达量最低的细胞表面标记物CD90。PE适用于配有488nm蓝色激光和640nm红色激光以及四个或更多荧光通道的流式细胞仪，大多数实验室或流式平台皆配备有满足该要求的流式细胞仪。数据采集、门控策略和亚群鉴定的优化设置取决于仪器，需要根据实验者自身的经验进行调整。下面是用于HSPC免疫表型分析的推荐荧光染料，包括相应的抗体，已经过内部测试，以在常用流式细胞仪分析时提供最佳分辨率和灵活性。

细胞表面标志物	荧光染料	克隆抗体	产品号 #
CD34	FITC	581	11-0349-42
CD38	APC	HIT2	17-0389-42
CD90	PE	5E10	12-0909-42
CD45RA	APC-Cy7	HI100	N/A
CD49f	PE	GoH3	12-0495-82

图1. CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺ HSC亚群的设门策略

4. 人造血干细胞（HSC）整体研究

5. 脐血CD34+原代细胞

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6. 造血干/祖细胞的分离

货号	名称
LSB1077	ImunoSep™ 人密度梯度细胞分离液
601015	SepTube™密度梯度离心管
601050	SepTube™密度梯度离心管
201050	HapClut™ D-PBS
212010	ImunoSep™红细胞裂解液
201054	HapClut™ PBS，pH7.4
AH0834125	Mouse anti-human CD34，Biotin
603110	ImunoSep™阳性分选试剂盒
604050	ImunoSep™细胞分选液
602005	ImunoSep™Separator (分选器)