图1.果蝇脑图像 （A）果蝇神经元的表达模式。 神经元树枝状结构由mCD8 :: GFP（绿色）标记，突触前末端用抗突触结合蛋白:: HA Ab（白色）标记，脑结构通过抗DLG免疫染色（蓝色）复染。 （B）光学投影神经元的三维可视化如图A所示。三个轴平行于果蝇脑的主轴。

图2.RapiClear1.49透明处理550um小鼠脊髓切片表达YFP神经元的深度成像。 用25倍镜头拍摄。 （A）冠状切面。（B）矢状剖面。  样品由中央研究院的Chia-Ming Lee博士提供。

图3.为在550um小鼠脑切片海马神经元中表达YFP的深度编码投影图像。 （A）样品用RapiClear1.49透明剂透明，25x镜头成像。 （B）用RapiClear1.52透明样品，63x油镜头成像。 样品由中央研究院的Chia-Ming Lee博士提供。

图4.胰岛微结构，血管系统和神经支配的成像。 绿色（标记凝集素）血管，蓝色胰岛（标记胰岛素）和洋红色神经（标记TUJ1）。 图片由Shiue Cheng教授（Tony）Tang提供。

RapiClear的特点：

& 兼容性：兼容各种内源荧光蛋白，亲脂示踪剂，核酸染色剂和Alexa Fluor染料。

& 简便：样品可以直接从缓冲溶液转移到RapiClear试剂中进行透明化。如果样品重新浸入缓冲溶液中，透明效果是可逆的。

RapiClear适用于什么样本？该如何选择使用？

不同样本透明所需时间：

iSpacer®（成像垫片）

透明剂的使用还需要搭配一种简单易用的小工具即 iSpacer，它能让您的实验操作更方便。 iSpacers由不同厚度的胶带制成。 通过简单地将间隔物按压到显微镜载玻片或盖玻片上，形成密封的防水孔以包含RapiClear®并防止蒸发。 在不压缩的情况，这些孔的形状比较稳定，其厚度足以支撑样品自由浮动，以便在分辨样品内部的精细结构。 样品和垫片可以夹在两个盖玻片之间。 同时，iSpacers可以堆叠到不同的深度，直接用于光，荧光或共聚焦显微镜。

面对不同类型的样本，iSpacer的规格也是多种多样：

RapiClear® CS mounting solution&mounting gel（透明剂&封片胶）

      SunJin Lab又推出一种更适合较大器官的透明剂，即使在几毫米的深度，样品图像质量也可以达到细胞水平分辨率。RapiClear CS是一种水溶性透明剂，其折射率与CLARITYTM（斯坦福大学）水凝胶组织杂交体相同（RI = 1.45nD）。 浸入RapiClear CS后，脂质提取的水凝胶组织变得均匀透明。 

图5.用抗TH抗体标记的小鼠脑，采用Lightsheet Z1（Zeiss）成像揭示了多巴胺能神经元网络。

iSpacers由不同厚度的胶带制成。 通过简单地将间隔物按压到显微镜载玻片或盖玻片上，形成密封的防水孔以包含RapiClear 并防止蒸发。 在不压缩的情况，这些孔的形状比较稳定，其厚度足以支撑样品自由浮动，以便在分辨样品内部的精细结构。 样品和垫片可以夹在两个盖玻片之间。 同时，iSpacers可以堆叠到不同的深度，直接用于光，荧光或共聚焦显微镜。

片使用方法：

具体操作步骤如下：

(A) 用无尘纸清洁载玻片及盖玻片 (大小: 22 x 30mm, 24 x 32mm, 或24 x 40mm) ；

(B) 撕掉 iSpacers上面的保护膜；

注: 同样应用于货号# IS004 和IS005iSpacer。

(C)将iSpacer粘性面朝下贴在载玻片或盖玻片的干燥表面上。 轻轻按压密封；

(D)  撕掉 iSpacers另一面上面的保护膜；

(E)可通过添加多个垫片增加样品孔深度。

(F) 撕掉增加的垫片保护膜；

(G) 在样品孔中加入适量的RapiClear；

(H) 将样品放入孔中；

(I) 用RapiClear填满孔；

(J) 盖上盖玻片，密封好样品；

(K) 轻轻按压盖玻片边缘，以确保安全密封；

(L) 用无尘纸擦除多余液体；

(M) 通过Neo-Mount （Merck，目录号109016）可以密封垫片外区域，在两个盖玻片之间形成硬膜。

根据您的实验需要，选择合适的iSpacer:

垫片选择

Single-sided sticky 

Double-sided sticky 

不同类型的小鼠脑样本适用不同的RapiClear组织透明试剂，具体请参照下表：

以≤1000μm厚度为例，小鼠脑切片透明化实验流程

1.       麻醉小鼠，并使用预冷的1×PBS每分钟10mL灌注小鼠，直到流出的PBS无色为止。

2.       用预冷的4%PFA灌流固定。剥离脑组织并将其浸泡在20mL PFA中。

3.       将脑组织置于PFA，4℃轻轻振荡过夜。

4.       用PBS清洗组织，置于摇床室温20分钟。

5.       脑组织可通过振荡切片机，冰冻切片或组织切片模具手动切片。

6.       将切片置于12孔板中，加入4%PFA，室温处理2小时。

7.       用PBS室温洗涤3次。

8.       将样本转移至2%PBST溶液（含2% Triton-X100），室温过夜透化。

9.       可选步骤：免疫染色

9-1. 加封闭缓冲液，置于振荡器或摇床4℃过夜。

9-2. 加入一抗置于摇床，4℃孵育3-5天。

9-3. 室温清洗样本，两次，每次不少于1小时。将样本置于清洗缓冲液（含3% NaCl 和0.2% Triton-X 100 的PBS）4℃摇床过夜。

9-4. 加入二抗，置于摇床，4℃孵育1-2天。

9-5. 室温清洗样本，两次，每次不少于1小时。将样本置于清洗缓冲液4℃摇床过夜。

10.   可选步骤：DAPI染色

10-1. 加入DAPI，4℃摇床过夜。DAPI（Invitrogen D3571,制备1mg/ml 储存液）以1:2000稀释后使用。

10-2. 用PBS清洗样本3次，每次20分钟。将样本置于新鲜PBS，4℃摇床过夜。

11.   用无尘纸吸去样本表面多余的PBS。

12.   加入1mLRapiClear 1.47或RapiClear 1.49透明试剂（透明试剂可重复使用，不要超过3次），置于摇床，数小时后观察透明程度。37℃预热透明试剂可有助于试剂渗透。样本透明后可进行观察，或置于室温数周不影响成像品质。

13.   将iSpacer粘在载玻片或盖玻片上，将样本置于iSpacer孔内，加入新鲜透明试剂，盖上盖玻片。用无尘纸吸去iSpacer周围多余液体。封片。

14.   用共聚焦显微镜或双光子显微镜观察。

样本：小鼠脊髓切片

1. 为获得最佳实验效果，需使用新鲜配制的冰冷 4% 多聚甲醛（PFA）溶液及生理盐水对实验动物进行心脏灌注。

2. 将解剖后的组织放入 50mL 离心管，加入 50mL 4% 多聚甲醛溶液，置于4℃摇床中过夜固定。

3. 用 50mL PBS 洗涤 3 次，每次 20 分钟，以去除残留 PFA。

4. 使用振动切片机进行组织切片，切片厚度建议250μm～600μm。

5. 将样本放入 5mL 离心管，加入2% PBST 溶液（含 0.05% 叠氮钠的 PBS 溶液，含 2% Triton X-100），34～35℃摇床孵育 3～6 天进行通透处理。（重要：离心管需水平放置）

6. 室温下用 5mL PBS 洗涤 3 次，每次 20 分钟，以去除 Triton X-100。

7. 免疫荧光染色步骤请严格参照RapiClear 透明试剂说明书。

• 封闭：1 天，4℃

• 一抗（多克隆抗体）：3～5 天，1:200 稀释，室温

• 二抗（Alexa Fluor 647）：3～5 天，1:200 稀释，室温

   

  免疫染色期间，将样本转入 2mL 离心管，加入对应抗体稀释液，置于摇床室温孵育。

8. 室温下用 5mL PBS 洗涤 3～4 次，每次 20 分钟，去除残留试剂。

9. 将样本放入 2mL 离心管，加入 DAPI 或 SYTOX 工作液，室温摇床孵育 1 天。

10. 室温下用 5mL PBS 再次洗涤 3～4 次，每次 30～60 分钟。（* 重要！）

11. 将样本放入 2mL 离心管，加入RC149 或 RC152 透明剂，室温过夜透明。

12. 使用iSpacer 微腔室，以新鲜 RC 试剂对透明后的样本进行封片。

13. 使用高速共聚焦显微镜成像，搭配高数值孔径、长工作距离的物镜（油镜 / 甘油镜 / 硅镜 / 水镜）以获得高质量图像，推荐型号：

-Nikon 20x/0.75NA multiple immersion (WD 0.51mm)

-Nikon 25x/1.05NA silicone immersion (WD 0.55mm)

-Nikon 20x/0.95NA water immersion (WD 0.95mm)

-Zeiss 25x/0.8 multiple immersion (WD 0.57mm)

-Leica 20x/0.75 multiple immersion (WD 0.68mm)

-Olympus 30x/1.05 silicone immersion (WD 0.8mm)

（* 重要！）

样本：小鼠完整脊髓

（本方案不建议使用带有荧光蛋白表达的样本）

1. 为获得最佳效果，应使用新鲜配制的冰冷 4% 多聚甲醛（PFA）溶液及生理盐水对实验动物进行灌注固定。

2. 将解剖后的脊髓组织放入 5 mL 离心管，加入 50 mL 4% 多聚甲醛溶液，于 4℃摇床过夜固定。

3. 用 50 mL PBS 洗涤 3 次，每次 20 分钟，以去除残留 PFA。

4. 使用 50 mL 甲醇 / PBS 梯度溶液进行脱水：25%、50%、75%、100% 甲醇，室温摇床孵育，每级 30 分钟。

5. 用 50 mL 无水甲醇洗涤 2 次，室温摇床，每次 30 分钟。

6. 用 50 mL 无水甲醇，室温摇床过夜处理。

7. 更换新鲜 50 mL 无水甲醇，室温摇床继续过夜。

8. 置于 50 mL 新鲜配制的 5% 过氧化氢 / 甲醇溶液中，室温摇床过夜漂白。

9. 使用 50 mL 甲醇 / PBS 梯度复水：100%、75%、50%、25% 甲醇，最后至 PBS，室温摇床孵育，每级 30 分钟。

10. 用 50 mL PBS 洗涤 3 次，室温摇床，每次 30 分钟。

11. 将样本置于 5 mL PBS 中，室温摇床孵育 2 天。

重要：离心管请水平放置。

12. 免疫荧光染色请严格按照 RapiClear 说明书第 2 页步骤操作。

• 封闭：2 天，4℃

• 一抗（多克隆抗体）：7 天，1:200 稀释，室温

• 二抗（Alexa Fluor 647 标记）：7 天，1:200 稀释，室温

   

免疫染色期间，将样本转入 5 mL 离心管，加入对应抗体稀释液，置于培养箱内摇床，室温孵育。

13. 用 50 mL PBS 洗涤 4～5 次，室温摇床，每次 30 分钟，以去除 Triton X-100。（重要）

14. 核酸染色（可选）：将样本置于 5 mL 离心管，加入 SYTOX Orange 工作液（推荐稀释比 1:3000～1:5000），室温摇床孵育 2 天。

15. 用 50 mL PBS 再次洗涤 4～5 次，室温摇床，每次 30～60 分钟。（重要）

16. 将样本置于 2 mL 离心管中，加入 RapiClear 1.52 透明剂，室温透明处理 1～2 天。

17. 使用 iSpacer ，以新鲜 RC152 试剂对透明后的组织样本进行封片。

18. 使用高速共聚焦显微镜进行成像，并选用 ** 高数值孔径（NA）、长工作距离（WD）** 的油镜 / 甘油镜 / 硅油镜 / 水浸物镜以获得高质量成像结果。（重要）

 胰岛是分布于胰外分泌部腺泡间的内分泌细胞团，含有丰富的神经血管，以调节激素分泌。早在Paul Langerhans发现胰岛的文献中，就已经描述了胰岛微结构，脉管系统和神经分布间的内在联系。在过去的100年中，由于2D组织学无法描述纷繁复杂的神经网管结构，胰腺3D的结构观察不透明性源于存在大量膜结构（主要是内质网和囊泡），其折射率比浸泡组织溶液如盐水或甘油的折射率高得多。折射率的不一致会引起散射，导致显微镜中光子穿透性差，因此，检查疾病（如肥胖症和糖尿病）中胰岛神经血管网络仍然是一项巨大挑战，直到透明技术出现......      

RapiClear®1.52（RC152）组织透明试剂具有1.52的超高折射率（nD = 1.52），达到脂质的折射率，使荧光显微镜光子以最小的散射穿过厚的胰腺样本。 当使用共聚焦显微镜观察RC152处理的样本，焦深大于500 µm，使胰岛微环境的3D可视化成为可能，在探索代谢性疾病中的胰岛神经血管重塑研究中至关重要。

RapiClear®1.52透明试剂特点：

- 样品可以直接从水、缓冲溶液或甘油转移到RapiClear®1.52透明剂中。

- 如果样品重新浸入水或缓冲溶液中，透明效果是可逆的。

- RapiClear®1.52即用型，无需离心。

- RapiClear®1.52使得在组织表面下方1~5 mm处目标清晰可见。

- RapiClear®1.52是一种抗冻液体。RapiClear®封片后，样品可在-20℃下长期保存。

实验方法：

1、4%多聚甲醛灌注小鼠。

2、分离胰腺，用4%多聚甲醛再次固定，15℃，40min。

3、用振荡切片机切400μm组织。

4、组织用2% Triton X-100处理15℃，2h

5、PBS洗涤切片，浸入封闭缓冲液（2% Triton X-100, 10% normal goat serum, and 0.02% sodium azide in PBS）。

6、一抗染色，15℃，1天。

7、DAPI 核染色，室温，1h。

8、加入RapiClear 1.52 透明处理。

9、封片，共聚焦显微镜观察。

染色结果：

 鳞状细胞癌（Epidermal carcinomas），即基底细胞癌（Basal Cell Carcinomas，BCC）和鳞状细胞癌（Squamous cell carcinomas，SCC）为人类常见恶性肿瘤。与这些癌症最相关的环境因素是紫外线（Ultraviolet）辐射，紫外线B（Ultraviolet-B）可导致直接诱变（Grimbaldeston等，2006年；Hart等人，2001；Halliday和Lyons，2008年）。长期光损伤的皮肤，表皮的整个区域都受到影响，导致出现多个肿瘤区。最近研究表明暴露在阳光下的正常皮肤，会发生基因的大量突变，包括已知的癌基因通常在SCC中找到（Martincorena和Campbell，2015年），证明暴露于紫外线的表皮细胞内潜在致癌能力。但是也可能提示突变不是引发肿瘤形成的唯一必要条件，因为即使带有致癌突变，皮肤仍保持正常。

    为了更好地了解紫外线（UV）照射对皮肤癌变初期的影响，我们检查标记的角质形成细胞斑块代表小泡间表皮（Interfollicular epidermis）中的克隆，并测量在UVB照射下它们的大小变化。多色谱系示踪显示在长期照射下皮肤上，靠近毛囊（HFs）的斑块增大，而远离毛囊的斑块不变。UVB中断后，HFs附近的斑块大小显著下降。增殖细胞的解剖学差异对研究基底细胞癌（BCC）的起源细胞有重要意义。紫外线诱导鼠BCC模型显示BCC斑块在HF附近出现更频繁，更大且更具侵入性。这些发现对预防表皮癌有重要意义。

研究思路和方法

 采用UVB照射3-10周小鼠，每周3次，且每两周增加0.5分钟照射时间，取3/5/8/10周不同时间点的毛发周期阶段的休止期，收集小鼠背部皮肤样本，做免疫组织化学染色及整个外显子组测序。

实验方法

1、处死小鼠，剃去毛发，收集皮肤组织样品

2、在4％PFA中固定2小时。

3、固定后，将整块背部皮肤样品在4℃下透膜并封闭过夜（封闭液1xPBS +0.5% TritonX， 2% BSA，20％正常山羊血清，1% DMSO和100mM 马来酸）。

4、在4℃下孵育一抗（ rabbit anti-keratin17和rabbit anti-keratin14）24小时。

5、用1:500稀释的Alexa Fluor 647 (Invitrogen)和Alexa Fluor 568 (Invitrogen) 二抗，4℃孵育24小时。

6、将整个皮肤组织样品在 0.2 mg/ml  DAPI中复染，4℃孵育过夜。

7、在 组织透明试剂RapiClear 1.52 中透明化处理3-6小时（SunJin Lab）。

8、将样品用防淬灭封片剂封片， 用Zeiss LSM 710共聚焦显微镜扫描，3D成像。

温馨提示：

1、对于较厚组织样本的荧光染色，荧光稳定性至关重要，因此建议选用稳定且信噪比较高的荧光染料，如Alexa Fluor 及Alexa Fluor  Plus 系列染料。

2、选择一种好口碑的组织透明试剂

SunJin Lab RapiClear 是一种无毒的水溶性组织透明试剂，含有防淬灭成分，染色的透明样品可以稳定储存两年。

小鼠骨髓（BM）切片

1. 分离小鼠股骨，用PBS冲洗。

2. 将分离好的股骨放入含2%多聚甲醛的PBS中， 4°C 固定 6 小时。

3. 取出股骨置于30% 蔗糖中，4°C脱水 72 小时。

4. OCT包埋，并在液氮中快速冷冻。

5. 用振荡切片机做横切和纵切。

BM免疫染色和组织透明

1. 用PBS洗涤骨切片 3 次，每次 5 分钟。

2. 将切片置于封闭液（含0.2% Triton X-100、1% BSA和10%驴血清的PBS）中， 4°C 孵育过夜。

3. 将切片用含一抗的封闭液在4°C下孵育 3 天。

4. 用PBS洗涤过夜。

5. 将切片用含二抗的封闭液在4°C下孵育 3 天。

6. 免疫染色后，将切片用 PBS 洗涤过夜。

7. 将切片转移至RapiClear 1.52 中孵育至少 6 小时。

8. 3D显微成像。

结果展示：

3D动画效果：

A.150um-300um类器官透明流程：

1. 取大小为150 μm～300 μm的类器官，加入2 mL 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，于4℃摇床或摆床固定 2 小时。
注意：过度固定会导致抗体穿透性变差、组织透明速度减慢、自发荧光背景升高。

2. 用2 mL PBS洗涤3～4 次，每次10 分钟，以去除残留 PFA。

3. 将样本转入2% PBST 溶液（2 mL 离心管，含 2% Triton X-100 与 0.05% 叠氮钠的 PBS），置于约 35℃培养箱、60～80 rpm 摇床通透处理1～2 天（依样本大小调整）。
重要：离心管需水平放置。

4. 用2 mL PBS洗涤3～4 次，每次20 分钟，以去除 Triton X-100。

5. 免疫荧光染色请严格按照RapiClear 说明书第 2 页步骤操作。

简要步骤建议如下：

• 封闭：1 天

• 一抗（多克隆抗体）：2～3 天，稀释比 1:200

• 二抗（Alexa Fluor 标记）：2～3 天，稀释比 1:200

免疫染色期间，将样本转入0.5 mL 离心管，加入抗体稀释液，置于培养箱内摇床，25℃或室温孵育。提高温度可加快抗体穿透，但会增加非特异性结合与背景信号。

重要：离心管需水平放置。

6. 室温下用2 mL PBS在摇床上洗涤3～4 次，每次30 分钟。（重要）

7. 可选步骤：将样本置于2 mL 离心管，加入 DAPI（1:1000）或 SYTOX（1:3000）核酸染色工作液，室温摇床孵育1 天。

8. 室温下用2 mL PBS在摇床上再次洗涤3～4 次，每次约30 分钟。（重要）

9. 将样本放入0.5 mL 离心管，加入 RapiClear 透明剂，室温摇床过夜透明（此步骤所用 RapiClear 可重复使用）。

10. 使用 iSpacer ，以新鲜 RapiClear 试剂对透明后的样本进行封片。

11. 使用高速共聚焦显微镜成像。建议选用 ** 高数值孔径（NA）、长工作距离（WD）** 的油镜 / 甘油镜 / 硅油镜 / 水浸物镜以获得高质量图像，推荐型号：

-Nikon 20x/0.75NA multiple immersion (WD 0.51mm)

-Nikon 25x/1.05NA silicone immersion (WD 0.55mm)

-Zeiss 25x/0.8NA multiple immersion/ 0.57mm WD

-Leica 20x/0.75NA multiple immersion/ 0.68mm WD

-Olympus 30x/1.05NA silicone immersion/ 0.8mm WD

(*重要!)

B. 1mm 类器官透明流程：

1. 取直径约 1 mm 的类器官，加入 5 mL 4% 多聚甲醛溶液，于 4℃ 摇床或摆床固定 4 小时。

    

   注意：过度固定会导致抗体穿透能力下降、组织透明速度减慢、自发荧光背景增强。
    
2. 用 5 mL PBS 洗涤 3～4 次，每次 15 分钟，以去除残留多聚甲醛。
    
3. 使用 5 mL 甲醇 / PBS 梯度溶液进行脱水：25%、50%、75%、100% 甲醇，室温摇床孵育，每级 20 分钟。
    
4. 用 5 mL 无水甲醇 洗涤 2 次，室温摇床，每次 20 分钟。
    
5. 加入 5 mL 无水甲醇，室温摇床过夜处理。
    
6. 使用 5 mL 甲醇 / PBS 梯度溶液复水：100%、75%、50%、25% 甲醇，最后用 PBS 平衡，室温摇床孵育，每级 20 分钟。
    
7. 用 5 mL PBS 洗涤 3 次，室温摇床，每次 20 分钟。
    
8. 将样本转入 2% PBST 溶液（5 mL 离心管，含 2% Triton X-100 及 0.05% 叠氮钠的 PBS 溶液），置于 约 35℃ 培养箱、60～80 rpm 摇床通透处理 2 天。

    

   重要：离心管需水平放置。
    
9. 用 5 mL PBS 洗涤 3～4 次，每次 30 分钟，以去除 Triton X-100。
    
10. 免疫荧光染色请严格参照 RapiClear 说明书第 2 页 步骤操作：https://www.sunjinlab.com/datasheet/

     

    简要推荐步骤如下：
     
    • 封闭：2 天
    • 一抗（多克隆抗体）：4～5 天，稀释比 1:200，室温
    • 二抗（Alexa Fluor 标记）：3～4 天，稀释比 1:200，室温
     
    免疫染色期间，将样本转入 2 mL 离心管，加入抗体稀释液，置于培养箱内摇床，室温孵育。

     

    重要：离心管需水平放置。
     
11. 室温下用 5 mL PBS 在摇床上洗涤 4～5 次，每次 30～60 分钟。（重要）
     
12. 可选步骤：将样本置于 5 mL 离心管，加入 SYTOX 核酸染色工作液（稀释比 1:3000～1:5000），室温摇床孵育 2 天。
     
13. 室温下用 5 mL PBS 在摇床上再次洗涤 4～5 次，每次 30～60 分钟。（重要）
     
14. 将样本放入 0.5 mL 离心管，加入 RapiClear 透明剂，室温摇床过夜透明。
     
15. 使用 iSpacer 微腔室，以新鲜 RapiClear 试剂对透明后的样本进行封片。
     
16. 使用共聚焦显微镜进行成像。为获得高质量成像效果，建议选用 ** 高数值孔径（NA）、长工作距离（WD）** 的油镜 / 甘油镜 / 硅油镜 / 水浸物镜。（重要）

1. 用4%新鲜多聚甲醛固定类器官，置于4℃摇床4-6小时。

2. 用PBS室温下洗涤3次，置于摇床，每次30 min。

3. 样品中加入含2% PBST（2% Triton X-100的PBS含 0.05% 叠氮化钠） 的5ml 管中置于摇床室温孵育2 天 

4. 用PBS室温下洗涤3次，置于摇床，每次30 min。

5. 免疫荧光检测简易步骤

- 封闭液封闭（Blocking）, 2天；

- 一抗, 1:200稀释，孵育4 天； 

- 二抗,1:200稀释，孵育3 天；

抗体的稀释浓度可根据不同厂家抗体要求进行稀释。

注：免疫荧光操作过程中，可将样品置于2mL管中，15℃摇床孵育一抗和二抗。

6. 样品转移至含RapiClear的2mL管中，RapiClear可反复使用数次。

7. 将透明的样品转移至载玻片，透明试剂中含抗淬灭封片剂，加RapiClear封片即可。

8. 共聚焦成像。较常用显微镜如Zeiss 25x/0.8 multiple immersion (WD 0.57mm), Leica 20x/0.75 multiple immersion (WD 0.68mm), Nikon 25x/1.05silicone immersion (WD 0.55mm), Nikon 20x/0.95 water immersion (0.95mm WD), and Olympus 30x/1.05 silicone immersion (WD 0.8mm)，均可获得较高品质的3D图像。

直径1.2mm之类脑器官(organoid)使用RC149进行透明化Organoid神经元表达GFP荧光蛋白的景深影像。