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1. 流式荧光补偿微球选择指南
2. UltraComp & OneComp eBeads 流式补偿微球
3. Abc 总抗体及 ArC 胺反应补偿微球
4. 荧光蛋白补偿微球

流式荧光补偿微球

流式荧光补偿微球搭配物种特异性的流式抗体相使用，还有其他类型试剂。它的目的是调整电压和画门参数，最终得到准确的荧光信号。在下述情形下，建议使用流式荧光补偿微球： 在同一检测通道中，多个荧光染料发射光谱相互重叠（图1） 低表达蛋白标记物在阳性和阴性细胞群中表现差异不明显 样本十分稀少，但可以跑完对照及得到足够的有效数据 在超多色免疫分型Panel中可以设置准确的单色补偿 在多色实验中微球对照可以实现标准化及节省样本

1. 流式荧光补偿微球选择指南

建议选择流式荧光补偿微球的标准是可以区分出抗体的阳性信号和阴性信号，我们有多种流式荧光补偿微球，适用于流式抗体、荧光蛋白及试剂。

流式抗体

 

 UltraComp eBeads Plus 补偿微球* 

 AbC 总抗体补偿微球试剂盒* 

 应用 

 免疫分型 

 免疫分型 

 反应性 

 人、兔、仓鼠、小鼠和大鼠来源抗体以及识别κ和λ链 

 仓鼠、小鼠、兔及大鼠抗体 

 形式 

 单管预混，每次一滴 

 1管阳性微球 1管阴性微球 

 激光 

 适用于多数标准激光，从紫外光到633nm，尤其适合在紫激光上聚合物染料抗体。 

 适用于多数标准激光，从紫外光到633nm。 

 规格 

 25 tests | 100 tests 

 25 tests | 100 tests 

 货号 

 01-3333-41 | 01-3333-42 

 A10513 | A10497 

LIVE/DEAD可固定细胞活性染料

 

 ArC 胺反应补偿微球试剂盒 

 应用 

 细胞活性检测 

 反应性 

 LIVE/DEAD 可固定细胞活性染料* 

 规格 

 1 管阳性微球； 1 管阴性微球 

 激光 

 可兼容大部分标准激光，从紫外光至633nm激光 

 规格 

 25 tests | 100 tests 

 货号 

 A10628 | A10346 

荧光蛋白(BrightComp eBeads)

 

 GFP 

 mCherry 

 RFP 

 CFP 

 YFP 

 应用 

 GFP (绿色荧光蛋白); 

 mCherry (单体红色荧光蛋白); 

 RFP (红色荧光蛋白); 

 CFP (青色荧光蛋白); 

 YFP (黄色色荧光蛋白); 

 微球被标记了3种强度的GFP 

 微球被标记了3种强度的mCherry 

 微球被标记了3种强度的RFP 

 微球被标记了3种强度的CFP 

 微球被标记了3种强度的YFP 

 反应性 

 GFP 亚型 

 mCherry 亚型 

 RFP 亚型 

 CFP 亚型 

 YFP 亚型 

 形式 

 单管预混，每次一滴 

 单管预混，每次一滴 

 单管预混，每次一滴 

 单管预混，每次一滴 

 单管预混，每次一滴 

 激光 

 488 nm 

 561 nm 

 561 nm 

 405 nm 

 488 nm 

 规格 

 1 mL (25 tests) 

 1 mL (25 tests) 

 1 mL (25 tests) 

 1 mL (25 tests) 

 1 mL (25 tests) 

 货号 

 A10514 

 A54743 

 A54740 

 A54742 

 A54743 

荧光补偿对照及微球

在流式多色实验中，若有荧光溢漏则需要补偿调节（图1）。基于抗原表达强度、荧光染料亮度及检测通道相间隔，选择合适荧光染料可以减少荧光溢漏效应，在小实验中可能不需做补偿调节。但是在更多参数和更多染料的实验中，调节光谱重叠的难度也随之更高。计算补偿需要未染色对照、FMO对照（fluorescence minus one）以及单色样本对照：

- 未染色样本可以确定自发荧光；

- FMO对照可以评估其他荧光染料及背景补偿调节的影响；

- 所有实验中需要使用荧光补偿微球这样的单色对照，调整画门条件及优化电压，得到清晰的阳性和阴性信号。

未染色样本及单色对照在光谱流式上同样设置参数。如果荧光补偿微球与样本一样亮或更亮，或若样本和微球的光谱非常不同，这时荧光补偿微球很有用。

显示3种荧光体激发和发射光谱的图示

图1.Panel Builder流式配色工具中三个荧光染料的发射光谱相互重叠案例。如果发射光谱很宽，荧光通道会有光谱重叠，这时其他荧光染料会由不同检测通道所检测。发射信号光谱重叠或荧光溢漏会产生误差。为了避免荧光溢漏，荧光补偿微球的计算机制是在同一检测通道中减去两个荧光染料的重叠部分，得到目标荧光信号。

荧光补偿

当在单一实验中使用两种或更多荧光染料时，一些特定荧光染料的部分散射光谱可能会与另一种荧光染料的检测范围相重合。为了确保荧光信号的检测具有特异性，荧光补偿的过程就是将混入该通道的其他荧光染料的信号进行数学上的削减。为了计算需要多少量的荧光补偿，必须在每次实验中使用单色对照样品。来自单一荧光染料但在其他通道里被检测得到的信号将会被检测到并通过荧光补偿将相应的信号进行去除。诸如Invitrogen UltraComp eBeads、OneComp eBeads和AbC抗体补偿微球，或者是经过实验中所使用的抗体进行染色的细胞，都可以用作单色对照。

光谱重叠图解

图1： 荧光补偿是通过数学算法对流式细胞数据进行校正来去除光谱的重叠。

荧光补偿微球的优势

荧光补偿微球可为流式细胞分析的补偿设置提供一种一致、准确并简易使用的工具。一致的荧光补偿微球可帮助用户避免因使用较弱荧光样品细胞进行补偿设置时而产生的不良补偿效果。荧光补偿微球可在多色实验的补偿中展现出一流的实用性，并还可与实验中使用的相同抗体进行联合使用（而非例如更亮的CD4替代物）。

荧光补偿微球适用于以下情况：

- 需要使用较强的信号对阳性细胞群进行补偿 

- 使用多孔板或较大规模实验时

- 细胞量有限，不能用于补偿对照

2. UltraComp & OneComp eBeads 流式补偿微球

在 Invitrogen eBeads 流式补偿微球中，抗体包被的阳性微球和抗体未包被的阴性微球相混合，装于小瓶中。单滴滴加 eBeads，使补偿更轻松。 UltraComp eBeads 流式补偿微球的优点如同 OneComp eBeads 一样，并且在 OneComp 的基础上，UltraComp 强化了在紫激光上的应用，还增加兔和人两个物种的反应性。UltraComp eBeads 强调的是您可以轻松上手使用，同时获得补偿调节的值。

表格 1：赛默飞流式补偿微球选择指南

 

 UltraComp eBeads Plus 流式补偿微球 

 UltraComp eBeads 流式补偿微球 

 OneComp eBeads 流式补偿微球 

 物种反应性 

 识别人、兔、仓鼠、小鼠和大鼠的 κ 和 λ 链 

 识别仓鼠、小鼠和大鼠的 κ 和 λ 链 

 识别仓鼠、小鼠和大鼠的 κ 和 λ 链 

 激光兼容性 

 可兼容大部分标准激光，从紫外至 633 nm 激光；优化了在紫激光上使用聚合物染料 

 可兼容大部分标准激光，从紫外至 633 nm 激光。 

 可兼容大部分标准激光，不可用于紫外光或紫激光。 

 规格 

 25 tests | 100 tests 

 25 tests | 100 tests 

 25 tests | 100 tests 

 货否 

 01-3333-41 | 01-3333-42 

 01-2222-41 | 01-2222-42 

 01-1111-41 | 01-1111-42 

UltraComp eBeads Plus 流式补偿微球

UltraComp eBeads Plus 流式补偿微球

紫激光激发的荧光染料越来越多，但传统补偿微球在应用紫激光时补偿值通常很小。UltraComp eBeads Plus 流式补偿微球是为了更加明亮信号，最终得到更加准确的荧光溢漏值。UltraComp eBeads Plus 流式补偿微球的优点：

  • 强化紫激光补偿应用，提高Super Bright和Brilliant Violet 流式荧光染料的补偿准确度（图 1）

  • 单管预混，每次一滴：这一滴包含抗体包被的阳性微球和抗体未包被的阴性微球

  • 多个物种反应性：人、兔子、仓鼠、小鼠和大鼠（图 2）

  • 识别 κ 链和 λ 链

图1.从人全血中分离细胞并重悬于 1X PBS 中。将微球涡旋至少 30 秒，并将一滴 UltraComp eBeads 或 UltraComp eBeads Plus 滴加至具有 1 x 106 个细胞中。向每个样品体积中加入 5 µL 下表所示的各种抗体。将样品避光孵育 20 分钟，然后用 1X PBS + 1% BSA 缓冲液洗涤。在 Attune NxT V6 流式细胞仪上上样样品。在补偿分析中，将每个文件导入 FlowJo 软件，并为单独细胞样本、加了UltraComp eBeads 样本或加了 UltraComp eBeads Plus 样本生成结果，最终比较数据图。

 蛋白靶标 

 荧光染料 

 克隆 

 亚型 

 货号 

 CD4 

 PE 

 RPA-T4 

 Mouse IgG1 

 12-0049-42 

 CD4 

 FITC 

 RPA-T4 

 Mouse IgG1 

 11-0049-42 

 CD19 

 SB436 

 HIB19 

 Mouse IgG1 

 62-0199-42 

 CD8a 

 SB780 

 HIB19 

 Mouse IgG1 

 78-0088-42 

 CD19 

 BV421 

 HIB19 

 Mouse IgG1 

 302233

 CD4 

 BV786 

 RPA-T4 

 Mouse IgG1 

 300553

图 2.将 UltraComp eBeads Plus 流式补偿微球与 14 种不同的 eFluor 450 染料偶联的抗体一起染色，包括流式细胞分析中常用亚型。 使用每种抗体（0.25 ug）将微球染色，并进行流式细胞分析。每个直方图代表一种染色抗体。

最佳方案：流式细胞术 UltraComp 补偿微球方案

 

材料

 

- 补偿微球：UltraComp eBeads（货号：01- 2222）或 UltraComp eBeads Plus（货号：01-3333-41）

- 未染色细胞

- 一抗（直接偶联）

- 流式染色缓冲液（货号：00-4222）

- 12 x 75 mm 圆底试管

注意：此方案可以用于 OneComp eBeads（货号：01-1111）。

 

实验步骤

 

步骤 I：单色补偿对照品的制备

 

  1. 给试管贴上荧光染料标签。
  2. 用力颠倒至少 10 次或脉冲涡旋，将微球混合均匀。
  3. 给每个试管贴上标签，脉冲涡旋 10 次。
  4. 向每个试管中加入 1 滴 UltraComp eBeads。
  5. 向每个试管中加入 1 次试验量或更少的抗体偶联物，混匀。
    • 注意：UltraComp eBeads 与含有 PBS 或 HBSS、牛血清白蛋白（BSA）或 FBS 等蛋白和叠氮化钠的标准染色缓冲液兼容。请勿使用其他添加剂。如需获取更多信息，请联系技术支持部。
    • 注意：一个试验是指用于细胞样本染色的抗体量（μg），最终体积为 100 μL。如果在阴性微球群体中观察较高的背景，则可以减少抗体的用量。在这种情况下，建议用量不超过 0.125 μg。由于抗体与阳性微球的结合与抗体的特异性无关，因此无需使用最佳浓度的抗体。对于大多数抗体， 0.03–1.0 μg 的量即可得到适合的补偿值。
  6. 轻弹、用力颠倒或脉冲涡旋混匀。
  7. 在 2-8°C 下避光孵育15-30 分钟。
  8. 向每个试管中加入 2 mL 的流式染色缓冲液，400-600 x g 离心 3-5 分钟。
  9. 倒出上清液，向每个试管中加入 0.2-0.4 mL 的流式染色缓冲液。
  10. 分析前，轻弹或脉冲涡旋混匀样本。

 

步骤 II：设置补偿的一般原则

 

  1. 在细胞仪上分析未染色的细胞。设置适当的正向散射（FSC）和侧向散射（SSC）以及荧光检测器（光电倍增管，PMT）的电压。

  2. 分析微球样本：调节 FSC/SSC，使微球（甚至可以是单色微球）在显示界面上。可以调节 FSC/SSC 大小来观察微球。

  3. 分析每个单色微球样本，确保阳性峰在正常范围内。如果微球的阳性峰超出正常范围，应尽可能降低 PMT 电压。检查所有单色微球确保阳性峰在正常范围之后，方可记录数据。

  4. 分析每个单色微球样本，进行补偿设置，保存补偿对照品文件。

  5. 重新设置细胞样本的 FSC/SSC ，获取样本的结果。

  6. 收集并保存样本结果。

注意：当物种是山羊和绵羊，应使用单色细胞和 FMO 对照品，不使用微球。

3. Abc 总抗体及 ArC 胺反应补偿微球

AbC 总抗体补偿试剂盒

 

三种 AbC 补偿微球试剂盒含有两种类型经特异修饰的聚苯乙烯微球：1）AbC捕获微球（也称为阳性微球），可与所有的特异性免疫球蛋白结合;2）阴性微球，不具有任何抗体结合能力。在与偶联有荧光素的一抗（不同试剂盒可能为小鼠、大鼠、仓鼠或兔抗）进行孵育后，两种不同的补偿微球可达到完全不同的阳性和阴性微球群体用于补偿设置。AbC 微球试剂盒设计用途是在进行阳性微球标记后再加入阴性微球，以避免在荧光逐渐向阴性微球转移。

四张直方图显示AbC™总抗体补偿珠套件的染色情况

图 3. 展示AbC 总抗体补偿微球试剂盒染色情况的四个直方图。直方图展示了与小鼠（左上）、大鼠（右上）、仓鼠（左下）单克隆抗体以及兔（右下）单克隆和多克隆抗体结合后，阳性捕获微球与阴性微球的信号分离。捕获微球上标记有最佳量的每种PE抗体偶联物并在Invitrogen Attune声波聚焦流式细胞仪上使用 488 nm激发波长和574/26带通滤波器进行分析。

 

ArC 胺反应补偿微球

 

Invitrogen ArC 胺反应补偿微球与 AbC 总抗体补偿微球具有相同的激光兼容性并具有两管形式，但可专门用于补偿 Invitrogen LIVE/DEAD 可固定死细胞染色剂。

ArC补偿珠套件直方图

图4： 采用 ArC胺反应补偿微球试剂盒以及 3种 LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒得到的染色图谱。 (A) LIVE/DEAD可固定紫色染料染色微球 在405 nm 激发发射并用 450/50 nm 带通滤波器进行收集分析。 (B) LIVE/DEAD可固定绿色染料染色微球 在488 nm 激发发射并用 525/50 nm 带通滤波器进行收集分析。 (C) LIVE/DEAD可固定红色染料染色微球 在633 nm 激发发射并用 660/20 nm 带通滤波器进行收集分析。

4. 荧光蛋白补偿微球

BrightComp eBeads荧光补偿微球

BrightComp eBeads荧光补偿微球是经过染色的微球，在GFP、mCherry、RFP、CFP和YFP上都表现有3种强度的荧光特征。BrightComp eBeads可以对样本中的GFP、mCherry、RFP、CFP和YFP轻松完成补偿调节（图5）。这些荧光补偿微球的优势有：

  • 轻松完成GFP、mCherry、RFP、CFP和YFP的补偿调节，结果可重复且准确；
  • 单管预混，每次一滴，一滴中含有阴性微球和阳性微球，十分轻松上手！

即刻在实验中使用BrightComp eBeads补偿微球，节省更多样本

5张流动直方图显示BrightComp eBeads荧光补偿珠各色荧光信号的强度

图5. BrightComp eBeads荧光补偿微球表现出不同的强度。荧光蛋白表达了不同水平，使得流式检测出不同的荧光强度。在补偿调节中建议选择比实验样本表达强度更高的微球波峰。这里的数据是在流式细胞仪上使用488 nm激光和525/50 nm滤光片收集GFP发射光谱，使用561 nm激光和620/15 nm滤光片收集mCherry发射光谱，使用561 nm激光和发射使用585/16 nm滤光片收集RFP发射光谱，使用488 nm激光并使用530/30 nm滤光片收集YFP发射光谱， 使用405 nm 激光器并使用 440/50 nm 滤光片使用 CFP 发射光谱。